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恒温摇床在植物高通量单细胞测序中的应用

由于细胞壁等因素的限制,植物的单细胞研究要稍晚于动物领域,目前植物单细胞文章主要是针对少量单细胞转录组异质性的研究,高通量水平还未应用到植物领域。2019年2月4日,美国密歇根大学John Schiefelbein实验室在线发表了拟南芥高通量单细胞转录组(scRNA)研究文章,发表杂志为Plant Physiology(IF=5.949),这也是第一篇将10x Genomics scRNA测序应用在植物中的发表文献。


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植物10x Genomics scRNA-seq一个很大的限制因素是无法获得高活力的原生质体,下面给出了上述文献中拟南芥根组织原生质体的制备流程,供参考,实际操作时需要根据研究的组织类型,对实验条件进行优化,例如解离酶的选择、解离酶的处理时间等。


1、溶液准备

清洗液:0.4 mM 甘露醇(Mannitol)、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA;

酶解液:1.25% (w/v) 纤维素酶Cellulase("ONOZUKA" R-10, Yakult)、0.1% (w/v)果胶酶Pectolyase (P-3026, Sigma-Aldrich)、0.4 mM Mannitol、20mM MES (pH 5.7)、20 mM KCl、10mM CaCl2、0.1% (w/v) BSA。


2、原生质体悬液制备

1)  取拟南芥根尖,切碎,70-μm滤器过滤;

2)  置于35 mm培养皿中,加入酶解液;

3)  放入恒温摇床(85 rpm),25°C酶解1h;

4)  500 g 离心10 min;

5)  离心,加入500 μL清洗液洗涤;

6)  40μm细胞滤器过滤原生质体悬液后,200g离心 6 min;

7)  清洗液重悬,确定原生质体浓度,冰上放置,可进行10x上机标记。


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