上海锦玟二维码,微信扫一扫有惊喜哦

24小时咨询热线
021-51095118

新闻动态

碱裂解法提取质粒DNA的原理、方法及各试剂的作用

实验原理

碱裂解法提取质粒DNA,是利用共价闭合环状质粒DNA与线性的染色体DNA片段在拓扑学上的差异来分离它们。在碱性环境中,细菌染色体DNA双螺旋结构解开变性,而质粒DNA的氢键虽断裂,但两条互补链仍相互盘绕处于结合缠绕状态。将溶液的pH调至中性并在高盐存在的条件下,染色体DNA、大分子量的RNA和蛋白质在SDS(十二烷基硫酸钠)的作用下形成沉淀,而质粒DNA仍然为可溶状态。通过离心,可除去大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质,而质粒DNA留在上清液中,通过酚/氯仿抽提纯化得到质粒DNA。

实验器材

恒温培养箱台式恒温摇床、高压灭菌锅、超净工作台、高速离心机、移液器、移液器吸头、三角瓶、1.5ml离心管、离心管架、带有pUC19质粒的大肠杆菌等。

实验试剂

(1)无水乙醇。

(2)LB培养基(1L):称量胰蛋白胨10.0g,酵母粉5.0g,氯化钠5.0g溶于800ml蒸馏水中,用1mol/L氢氧化钠溶液(或1mol/L盐酸溶液)调节pH至7.0,然后加蒸馏水至1000ml,高温高压灭菌后备用。

(3)质粒小提试剂盒(离心柱型),试剂盒的产品组成如下:

1)平衡液BL。

2)溶液P1:50mmol/L葡萄糖,25mmol/L Tris-Cl(pH8.0),10mmol/L EDTA(pH8.0)。

3)溶液P2:0.2mol/L NaOH,1%SDS。

4)溶液P3:称取29.4g乙酸钾和11.5ml冰乙酸混合,加H2O至100ml。

5)去蛋白液PD。

6)漂洗液PW。

7)洗脱缓冲液EB。

8)RNase A。

9)吸附柱CP3。

10)2ml收集管。

实验操作

(1)接一环新鲜菌体于5ml含有适当抗生素的液体培养基中,37℃摇床(200rpm)过夜培养。

(2)柱平衡步骤:向吸附柱CP3中(吸附柱放入收集管中)加入500μl的平衡液BL,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。

(3)将1.5ml过夜培养菌液放于离心管中,12000rpm离心1min,弃去上清液,收集菌体。

(4)向留有菌体沉淀的离心管中加入250μl溶液P1,使用移液器吹打彻底悬浮菌体沉淀,使菌体悬浮均匀。

(5)向离心管中加入250μl溶液P2,温和地上下翻转6~8次,使菌体充分裂解,菌液变得清亮黏稠。

(6)向离心管中加入350μl溶液P3,立即温和地上下翻转6~8次,充分混匀,此时会出现白色絮状沉淀。12000rpm离心10min。

(7)用移液器吸出步骤(6)收集的上清液,转移到吸附柱CP3中,注意尽量不要吸出沉淀,12000rpm离心10min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3重新放回收集管中。

(8)向吸附柱CP3中加入500μl漂洗液PW,12000rpm离心1min,倒掉收集管中的废液,将吸附柱CP3放入收集管中。

(9)重复操作步骤(8)。

(10)将吸附柱CP3放入收集管中,12000rpm离心2min,目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除。

(11)将吸附柱CP3置于一个干净的离心管中,向吸附膜的中间部位滴加50~100μl洗脱缓冲液EB,室温放置2min,12000rpm离心2min,将质粒溶液收集到离心管中。

注意事项

(1)溶液P1在使用前先检查是否已加入RNase A,每次实验结束后应置于2~8℃环境中保存。

(2)温度较低时,溶液P2会出现白色沉淀,可在37℃水浴中加热几分钟,摇匀后使用。

(3)注意离心机的平衡问题,所有离心步骤均为使用常规台式离心机在室温下进行离心。

实验意义

质粒是共价、闭合、环状的小分子量DNA,在基因工程中,质粒是目的基因的载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA在分子生物学上是一种最基本的方法。


全国咨询热线

021-51095118

177-2115-2891

Copyright © 2019-2020 上海锦玟仪器设备有限公司 www.shjinwen.cn 版权所有
地址:上海市奉贤区青村镇奉柘公路3108号 电话:021-51095118 手机:177-2115-2891 邮箱:jinwensh@163.com
中华人民共国和工信部备案号:沪ICP备19013904号-3

丁工:

陈工:

吴工:

服务时间:
9:00-18:00(工作日)

cache
Processed in 0.007966 Second.